在實(shí)際工作中，在金溶膠中加入蛋白質(zhì)后，會(huì)由于靜電、疏水和范德華力相互作用而引發(fā)其在金顆粒表面的自發(fā)吸附，這是膠體金標(biāo)記得以進(jìn)行的基礎(chǔ)。離開這個(gè)基礎(chǔ)，膠體金標(biāo)記是沒辦法進(jìn)行的。
為了制備金顆粒標(biāo)記的蛋白質(zhì)，通常先將將金懸浮液攪拌混勻（你肯定遇到過這種情況：如果顆粒比較大，放置一段時(shí)間會(huì)出現(xiàn)顆粒下沉，注意此處不是金顆粒形態(tài)發(fā)生變化導(dǎo)致的聚沉！而只是因?yàn)橹亓ψ饔靡鸬恼＝痤w粒在溶液中的非均勻分布。因此標(biāo)記時(shí)候需要混勻后使用），同時(shí)加入大量的蛋白質(zhì)。當(dāng)金顆粒與蛋白質(zhì)分子結(jié)合時(shí)，隨著金顆粒變得穩(wěn)定和裸金顆粒的減少，特征波長處的吸光度通常會(huì)下降。為了檢查吸附過程的完整性，并確定金顆粒是否完全被飽和標(biāo)記，我們可以取一部分液體，并加入少量氯化鈉溶液。如果在加入氯化鈉后發(fā)生聚沉，則說明金顆粒還有沒被蛋白吸附存在比較多的裸金顆粒，應(yīng)該添加更多的蛋白質(zhì)來進(jìn)一步吸附裸金顆粒。最后，通常會(huì)添加聚乙二醇（PEG）或免疫反應(yīng)阻斷劑，如BSA或脫脂奶粉溶液，來進(jìn)一步穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)合后的膠體懸液。這些封閉蛋白基本會(huì)完全占據(jù)絕大分部分潛在的金-金復(fù)合物或金-蛋白復(fù)合物相互作用的剩余位點(diǎn)，從而防止了在存儲(chǔ)、檢測過程中的聚集或非特異性結(jié)合。
關(guān)于待標(biāo)記蛋白用量，大部分研發(fā)人員通常的做法是：先確定防止Nacl造成的聚集的最少蛋白質(zhì)所需量，在此基礎(chǔ)上增加約10-20%的過量蛋白（霍里斯伯格和羅塞特，1977；De Mey等人，1981）。但這個(gè)確定蛋白具體用量多少的工作其實(shí)針對(duì)大部分項(xiàng)目或者新手研發(fā)人員來說，已經(jīng)沒有太多必要去動(dòng)手再確定到底多少蛋白才是最少量，除非是項(xiàng)目蛋白成本很高，你可以去做個(gè)試驗(yàn)往下走走好好降降成本。膠體金技術(shù)這么多年下來，N多的被后浪拍在沙灘上且已經(jīng)被曬得嘎嘣脆的研發(fā)前輩早已經(jīng)留下了適合絕大部分項(xiàng)目標(biāo)記的蛋白使用量。通常來說10ug/ml的用量已經(jīng)絕對(duì)能讓你的蛋白豐度夠到姥姥家了，筆者甚至試過3ug/ml的用量姥姥家都表示夠用了。但是需要注意的是，如果你使用的金溶液濃度比較高的話，還是需要相應(yīng)按照適當(dāng)?shù)谋壤岣叩鞍椎氖褂昧浚駝t姥姥就有可能告訴你蛋白用量有點(diǎn)點(diǎn)不那么給力了。
總體來說，為了獲得比較理想的標(biāo)記物之外，在用金顆粒標(biāo)記蛋白質(zhì)時(shí)，需要考慮幾個(gè)參數(shù)：
(1)蛋白質(zhì)的pI，
(2)吸附過程的pH，
(3)標(biāo)記反應(yīng)中的蛋白質(zhì)的量。
一般認(rèn)為，大多數(shù)蛋白質(zhì)可以在其等電點(diǎn)或附近最大限度地和膠體金顆粒進(jìn)行吸附（Norde，1986）。但是就pH這個(gè)參數(shù)，在金標(biāo)記過程中再怎么強(qiáng)調(diào)也不為過，甚至可以說“成也pH，敗也pH”.這個(gè)參數(shù)對(duì)憑金標(biāo)記這個(gè)技能混江湖的人來說絕對(duì)算得上是內(nèi)家真氣般的存在。沒有一定程度的修煉是不好去江湖隨便飄的。甚至有些待標(biāo)記蛋白的純度、性能決定了標(biāo)記過程pH會(huì)出現(xiàn)和常規(guī)做法特別不一樣的要求，先舉例說明如下：
A、對(duì)于許多蛋白質(zhì)，特別是抗血清來源的免疫球蛋白，平均pI是一個(gè)包含一系列pH值的范圍。因此，多克隆抗體制備可能具有與特定純化的單克隆抗體非常不同的平均pI。這一點(diǎn)相信廣大金標(biāo)研發(fā)人員是有所體會(huì)的，通常就是多抗比較好標(biāo)記，但是活性不盡如人意，單抗雖然沒多抗好標(biāo)，但標(biāo)記出來后效果喜人。原因就在于此。
B、另外一點(diǎn)，個(gè)別蛋白對(duì)pH非常挑剔，當(dāng)你用第一步調(diào)整好pH的金溶液中加入蛋白后，一切反應(yīng)都很和諧、美好，反應(yīng)的頁面也很絲滑，但當(dāng)你第二次加入封閉蛋白后滿懷希望的等待收貨美好的標(biāo)記物時(shí)，詭異、慘烈的畫面通常會(huì)出來把你英俊瀟灑的臉摁花崗巖地面上摩擦一頓：你會(huì)發(fā)現(xiàn)溶液會(huì)慢慢的、逐漸的變成藍(lán)色、或者紫色，甚至?xí)谐恋砦龀觯似凡畹乃詈笾苯訒?huì)給你變成一汪清水！咦，他怎么就變色兒呢？他怎么能變色了呢！問題是，你這一變色兒，你讓你旁邊新招來的實(shí)驗(yàn)助手小妹妹對(duì)你那崇拜的眼神往何處安放？！是啊，他怎么就變色兒了呢？其實(shí)，這個(gè)問題主要是就是待帶標(biāo)記蛋白對(duì)pH非常敏感造成的，加入封閉蛋白后改變了溶液pH所致，需要你在加入封閉蛋白過程中持續(xù)穩(wěn)定溶液的pH才能讓標(biāo)記過程進(jìn)行下去。
就算你確定好了標(biāo)記pH，咱們通常會(huì)加入碳酸鉀到金溶液里邊去，然后再攪拌。但是，我告訴你，你如果對(duì)你的pH計(jì)下手夠狠的話，你可以用探頭直接伸入到你的金溶液里邊，然后睜大眼睛瞅個(gè)faiwu分鐘，我保證你會(huì)看見一個(gè)魔幻的情況出現(xiàn)：你調(diào)整好的金溶液的pH它就像遙遠(yuǎn)星空的星光一樣一閃一閃的在你眼前欻欻跳動(dòng)并且一直往下降。通常faiwu分鐘估計(jì)至少能給你掉個(gè)0.5個(gè)pH！厲害吧，刺激吧？是不是又聽到了你那英俊的臉和花崗巖摩擦的呲呲聲！開始我遇到這種情況就傻眼了，心想：這啥情況哇！那啥、實(shí)驗(yàn)前我特意用清水洗手了三遍吶！看見小偷偷東西我也喊了呀！公交車上我也給老奶奶讓座了哇，過斑馬線我也沒闖紅燈撒。臥槽，肯定是過馬路的時(shí)候走在我身邊的老奶奶我沒扶她！其實(shí)不是我不想扶她，是她走路速度比我快！等你在心里對(duì)心靈徹底來一次滌蕩后，我們來處理這個(gè)問題，原則就是：多次平衡，盡快結(jié)合。多次平衡控制pH的下降幅度，盡快結(jié)合縮短波動(dòng)時(shí)間。
雖然我們說蛋白質(zhì)與金顆粒的標(biāo)記沒有普遍一致的標(biāo)準(zhǔn)，但可以通過遵循下面這些一般準(zhǔn)則來提高標(biāo)記過程的效率：
(1)在pH的pI范圍內(nèi)或略高于pI；但在實(shí)際中往往這個(gè)策略效果一般，真的勇者往往出其不意而獲得意外之喜。期待你也一樣！大膽往往能讓你成為整個(gè)實(shí)驗(yàn)室最靚的仔！
(2)向金顆粒注入的蛋白質(zhì)量比氯化鈉破壞實(shí)驗(yàn)時(shí)略高（約10%）；
(3)避免蛋白質(zhì)的高飽和，因?yàn)檫@可能會(huì)促進(jìn)結(jié)合材料的浸出；這點(diǎn)真的可以采納，10ug/ml用量絕對(duì)姥姥家夠了，甚至舅舅家也都?jí)蛄?。省時(shí)間可以直接用這個(gè)量，省出寶貴時(shí)間給實(shí)驗(yàn)助手培訓(xùn)下理論和實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)的細(xì)節(jié)它不香嗎？
(4)通過測定溶液在特征波長處的吸光度來評(píng)價(jià)金顆粒的吸附程度和聚沉程度；
(5)優(yōu)化每個(gè)蛋白質(zhì)-金顆粒偶聯(lián)物，來確定膠體的穩(wěn)定性和活性。優(yōu)化工作是個(gè)細(xì)活，需要花時(shí)間和精力去做、熬，這是也絕大部分小白菜成長為大神的最好的路、其實(shí)也是最好的捷徑。這個(gè)工作相當(dāng)于在對(duì)標(biāo)記工作做PDCA持續(xù)改進(jìn)，同時(shí)、他對(duì)你獲取、維持實(shí)驗(yàn)室標(biāo)記崗位的王霸之位有舉足輕重的作用，實(shí)踐出真知，真知出權(quán)威。
如此，只要是在每次標(biāo)記的過程中出現(xiàn)詭異事件，江湖的朋友會(huì)不約而同的翹首以盼且眾望所歸于你身上，希望你重出江湖，一劍定乾坤！當(dāng)然也少不了收獲你助手小妹妹那崇拜的眼光！
2023-8-21 |
