2023年10月7日，國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布《關(guān)于公開征求《人源干細(xì)胞產(chǎn)品非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則（征求意見稿）》意見的通知》，指導(dǎo)原則明確在非臨床研究中需要考慮以下因素（包括但不限于）：細(xì)胞來源、生物學(xué)特性、作用機(jī)制；生產(chǎn)過程（如體外培養(yǎng)、 純化、誘導(dǎo)分化、擴(kuò)增、基因修飾/改造等）；終產(chǎn)品中不同分化階段細(xì)胞的數(shù)量/比例；終產(chǎn)品中可能殘留的非目的細(xì)胞（如未分化細(xì)胞、非預(yù)期分化細(xì)胞等）、非細(xì)胞成分（如雜質(zhì)/外源因子等）；臨床擬用人群、給藥方式、預(yù)期的藥理作用靶部位；細(xì)胞在受者體內(nèi)的遷移、定植、分化及存續(xù)能力；細(xì)胞的免疫原性和受者對細(xì)胞的免疫反應(yīng)；成瘤性和致瘤性的風(fēng)險(xiǎn)等。對于指導(dǎo)原則中明確的考慮因素，盡早布局相關(guān)檢測。
分子檢測
基因表達(dá)分析：通過檢測細(xì)胞中特定的基因是否被激活或沉默，可以判斷細(xì)胞的類型和狀態(tài)。例如，人胚干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞通常表達(dá)一些多能性基因，如OCT4, SOX2, NANOG等，而人的成體干細(xì)胞則不表達(dá)或表達(dá)很低?；虮磉_(dá)分析的方法有很多，如實(shí)時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR, RT-qPCR）、微陣列（microarray）、轉(zhuǎn)錄組測序（transcriptome sequencing）等。
蛋白質(zhì)檢測：通過檢測細(xì)胞表面或內(nèi)部的特定的蛋白質(zhì)，可以判斷細(xì)胞的類型和狀態(tài)。例如，人胚干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞通常表達(dá)一些多能性標(biāo)志物，如SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81等，而人的成體干細(xì)胞則不表達(dá)或表達(dá)很低。蛋白質(zhì)檢測的方法有很多，如免疫熒光染色（immunofluorescence staining）、流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry）、免疫印跡法（immunoblotting）等。
表觀遺傳分析：通過檢測細(xì)胞中DNA或組蛋白的甲基化、乙?；刃揎?，可以判斷細(xì)胞的類型和狀態(tài)。例如，人胚干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞通常具有一種稱為雙向啟動子（bivalent promoter）的表觀遺傳特征，即同時存在著激活和沉默基因的修飾，使得它們可以在適當(dāng)?shù)男盘栂驴焖俜只癁椴煌募?xì)胞類型。而人的成體干細(xì)胞則沒有這種特征。表觀遺傳分析的方法有很多，如甲基化敏感性限制酶消化法（methylation-sensitive restriction enzyme digestion）、雙鏈DNA免疫沉淀法（double-stranded DNA immunoprecipitation）、染色質(zhì)免疫沉淀法（chromatin immunoprecipitation）等。
基本因素檢測
細(xì)胞來源：細(xì)胞來源是指干細(xì)胞產(chǎn)品中的細(xì)胞是從哪里獲取的，例如胚胎、臍帶血、骨髓、脂肪等。細(xì)胞來源可以通過一些標(biāo)志物來鑒定，例如表面抗原、轉(zhuǎn)錄因子、基因表達(dá)等。一些常用的檢測方法有流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光、實(shí)時熒光定量PCR等。
生物學(xué)特性：生物學(xué)特性是指干細(xì)胞產(chǎn)品中的細(xì)胞具有的一些功能和性能，例如自我更新能力、增殖能力、分化能力、免疫原性等。生物學(xué)特性可以通過一些實(shí)驗(yàn)來評估，例如集落形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期分析、分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)等。
作用機(jī)制：作用機(jī)制是指干細(xì)胞產(chǎn)品在體內(nèi)發(fā)揮治療作用的原理和途徑，例如遷移、定植、分化、分泌因子等。作用機(jī)制可以通過一些模型和技術(shù)來探究，例如動物模型、熒光標(biāo)記、基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)等。
示例：干細(xì)胞來源檢測產(chǎn)品
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采用一種基于引物探針的熒光報(bào)告系統(tǒng)，利用特異性的引物和探針來擴(kuò)增和檢測不同來源的干細(xì)胞中的特征性基因或轉(zhuǎn)錄因子。例如，胚胎干細(xì)胞中的OCT4、NANOG、SOX2等，臍帶血干細(xì)胞中的CD34、CD133等，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的CD44、CD90等。
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使用多重實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，可以在同一反應(yīng)管中同時檢測多個靶標(biāo)，并使用不同顏色的熒光染料來區(qū)分。這樣可以提高檢測效率和準(zhǔn)確性，同時節(jié)省試劑和樣品。
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提供一套完整的反應(yīng)體系和操作流程，包括模板提取、反應(yīng)混合液配制、PCR反應(yīng)條件設(shè)置、數(shù)據(jù)分析軟件等。用戶只需按照說明書操作，即可獲得可靠的結(jié)果。
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提供一系列的質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品，用于驗(yàn)證反應(yīng)體系的性能和建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過比較未知樣品的閾值循環(huán)數(shù)（CT值）和標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計(jì)算出未知樣品中干細(xì)胞的起始拷貝數(shù)和來源。
生產(chǎn)過程檢測
基于微流控芯片的干細(xì)胞培養(yǎng)和純化系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)高效、精確和可控的干細(xì)胞培養(yǎng)和分離。利用微流控技術(shù)，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的流速、溫度、氣體等參數(shù)，模擬干細(xì)胞的生理環(huán)境，促進(jìn)其增殖和分化。同時還可以利用微流控閥門和電泳技術(shù)，根據(jù)干細(xì)胞的大小、形狀、電荷等特性，實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞的純化和收集。
基于核酸適配體的干細(xì)胞誘導(dǎo)分化，可以實(shí)現(xiàn)高效、簡便和特異的干細(xì)胞誘導(dǎo)分化。利用核酸適配體技術(shù)，通過篩選出能夠特異性結(jié)合干細(xì)胞表面受體的核酸分子，模擬生長因子或細(xì)胞因子的作用，激活干細(xì)胞的信號通路，誘導(dǎo)其向目標(biāo)細(xì)胞類型分化。目的要求具有低毒性、低免疫原性、低成本等優(yōu)點(diǎn)。
基于CRISPR/Cas9技術(shù)的干細(xì)胞基因編輯工具，可以實(shí)現(xiàn)高效、精確和靈活的干細(xì)胞基因修飾或改造。該工具利用CRISPR/Cas9技術(shù)，通過設(shè)計(jì)能夠特異性識別目標(biāo)基因序列的導(dǎo)向RNA（gRNA），結(jié)合Cas9核酸酶，實(shí)現(xiàn)對干細(xì)胞基因組的切割或插入。該工具可以用于增加或減少干細(xì)胞的功能基因，或者引入外源基因，改變干細(xì)胞的表型或功能。
終產(chǎn)品檢測
基于熒光活細(xì)胞成像儀的干細(xì)胞分化分析系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)高通量、高分辨率和動態(tài)的干細(xì)胞分化過程的監(jiān)測和定量。該系統(tǒng)利用熒光活細(xì)胞成像儀，通過設(shè)置不同的波長和濾鏡，對干細(xì)胞分化過程中表達(dá)的特異性熒光蛋白進(jìn)行連續(xù)拍攝和記錄。通過對圖像進(jìn)行分析，可以計(jì)算出不同分化階段細(xì)胞的數(shù)量、比例、形態(tài)、遷移等參數(shù)。該系統(tǒng)可以用于評估干細(xì)胞分化效率、穩(wěn)定性和一致性。
基于流式細(xì)胞術(shù)的干細(xì)胞分化鑒定，可以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確和特異的干細(xì)胞分化狀態(tài)的鑒定。利用流式細(xì)胞術(shù)，通過使用不同的熒光標(biāo)記抗體，對干細(xì)胞分化過程中表達(dá)的特異性表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測和計(jì)數(shù)。通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以確定干細(xì)胞分化為哪些細(xì)胞類型，以及各種細(xì)胞類型的數(shù)量和比例。最終用于評估干細(xì)胞分化質(zhì)量、純度和多樣性。
基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的干細(xì)胞分化譜系重建，實(shí)現(xiàn)高深度、高靈敏度和高分辨率的干細(xì)胞分化過程的解析和重建。利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，通過對干細(xì)胞分化過程中每個單個細(xì)胞的全基因組表達(dá)水平進(jìn)行測定和比較。通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類、降維、軌跡推斷等方法，揭示干細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵基因、信號通路、轉(zhuǎn)錄因子等因素，以及各種分化階段之間的關(guān)系和轉(zhuǎn)換。最終用于評估干細(xì)胞分化機(jī)制、潛能和多樣性。
非目的殘留檢測
干細(xì)胞終產(chǎn)品中可能殘留的非目的細(xì)胞和非細(xì)胞成分是影響干細(xì)胞產(chǎn)品安全性和有效性的重要因素，需要進(jìn)行嚴(yán)格的檢測和控制。
非目的細(xì)胞：非目的細(xì)胞是指干細(xì)胞產(chǎn)品中不符合預(yù)期目標(biāo)的細(xì)胞，例如未分化細(xì)胞、非預(yù)期分化細(xì)胞等。這些細(xì)胞可能會導(dǎo)致受者體內(nèi)發(fā)生不良反應(yīng)，如免疫排斥、炎癥、腫瘤等。
細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測：利用特異性抗體或熒光染料，對干細(xì)胞產(chǎn)品中表達(dá)的特定細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測，以區(qū)分不同類型和狀態(tài)的細(xì)胞。例如，利用CD34、CD133等抗體，檢測干細(xì)胞產(chǎn)品中是否含有未分化或部分分化的造血干細(xì)胞。一些常用的技術(shù)有流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。
基因表達(dá)檢測：利用特異性引物或探針，對干細(xì)胞產(chǎn)品中表達(dá)的特定基因或轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行檢測，以區(qū)分不同類型和狀態(tài)的細(xì)胞。例如，利用OCT4、NANOG、SOX2等引物或探針，檢測干細(xì)胞產(chǎn)品中是否含有未分化或部分分化的多能干細(xì)胞。一些常用的技術(shù)有實(shí)時熒光定量PCR、原位雜交、基因芯片等。
非細(xì)胞成分：非細(xì)胞成分是指干細(xì)胞產(chǎn)品中除了目標(biāo)細(xì)胞以外的其他成分，例如雜質(zhì)/外源因子等。這些成分可能會影響干細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性，或者對受者體內(nèi)造成污染或毒性。
內(nèi)毒素檢測：內(nèi)毒素是一種由革蘭氏陰性菌釋放的脂多糖，具有強(qiáng)烈的致炎和致死作用。內(nèi)毒素可能會污染干細(xì)胞產(chǎn)品中使用的培養(yǎng)液、添加劑或器械等。
微生物檢測：微生物是指干細(xì)胞產(chǎn)品中可能存在的細(xì)菌、真菌、病毒等微小生物，可能會導(dǎo)致干細(xì)胞產(chǎn)品的污染或受者體內(nèi)的感染。
免疫性原性
細(xì)胞的免疫原性和受者對細(xì)胞的免疫反應(yīng)是影響干細(xì)胞產(chǎn)品安全性和有效性的重要因素，需要進(jìn)行嚴(yán)格的檢測和控制。一些常用的檢測方法有：
細(xì)胞的免疫原性：細(xì)胞的免疫原性是指干細(xì)胞產(chǎn)品中的細(xì)胞是否能夠被受者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)識別和攻擊，導(dǎo)致免疫排斥或耐受。細(xì)胞的免疫原性主要取決于細(xì)胞表面表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合物（MHC）分子，以及其他共刺激分子、附屬分子等。細(xì)胞的免疫原性的檢測方法主要有：
MHC分型：利用特異性抗體或探針，對干細(xì)胞產(chǎn)品中表達(dá)的MHC分子進(jìn)行檢測，以確定其與受者體內(nèi)MHC分子的相似度或差異度。一些常用的技術(shù)有流式細(xì)胞術(shù)、PCR-SSP、PCR-SSO等。
共刺激分子和附屬分子檢測：利用特異性抗體或探針，對干細(xì)胞產(chǎn)品中表達(dá)的共刺激分子和附屬分子進(jìn)行檢測，以評估其對受者體內(nèi)T細(xì)胞活化或抑制的影響。一些常用的技術(shù)有流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時熒光定量PCR等。
受者對細(xì)胞的免疫反應(yīng)：受者對細(xì)胞的免疫反應(yīng)是指干細(xì)胞產(chǎn)品在受者體內(nèi)引發(fā)的免疫應(yīng)答，包括體液免疫和細(xì)胞免疫兩種類型。受者對細(xì)胞的免疫反應(yīng)主要取決于干細(xì)胞產(chǎn)品與受者體內(nèi)MHC分子的匹配程度，以及其他因素如給藥方式、劑量、頻率等。受者對細(xì)胞的免疫反應(yīng)的檢測方法主要有：
體液免疫檢測：利用特異性抗體或抗原，對受者血清中存在的針對干細(xì)胞產(chǎn)品中細(xì)胞或其成分的抗體進(jìn)行檢測，以評估其對干細(xì)胞產(chǎn)品在體內(nèi)存活和功能的影響。一些常用的技術(shù)有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光抗體試驗(yàn)等。
細(xì)胞免疫檢測：利用特異性抗原或抗體，對受者外周血單個核細(xì)胞（PBMC）中存在的針對干細(xì)胞產(chǎn)品中細(xì)胞或其成分的T細(xì)胞進(jìn)行檢測，以評估其對干細(xì)胞產(chǎn)品在體內(nèi)存活和功能的影響。一些常用的技術(shù)有混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、ELISPOT、流式細(xì)胞術(shù)等。
成瘤性和致瘤性
成瘤性和致瘤性的風(fēng)險(xiǎn)是指干細(xì)胞產(chǎn)品中的細(xì)胞是否能夠在受者體內(nèi)形成腫瘤或誘發(fā)腫瘤，導(dǎo)致嚴(yán)重的不良后果。成瘤性和致瘤性的風(fēng)險(xiǎn)主要取決于干細(xì)胞產(chǎn)品中的細(xì)胞類型、分化狀態(tài)、基因穩(wěn)定性、免疫相容性等因素。
細(xì)胞類型和分化狀態(tài)檢測：利用特異性抗體或探針，對干細(xì)胞產(chǎn)品中表達(dá)的特定細(xì)胞類型或分化狀態(tài)的標(biāo)志物進(jìn)行檢測，以評估其是否具有成瘤或致瘤潛能。例如，利用OCT4、NANOG、SOX2等標(biāo)志物，檢測干細(xì)胞產(chǎn)品中是否含有未分化或部分分化的多能干細(xì)胞，這些細(xì)胞具有較高的成瘤性。利用p53、Rb、Bcl-2等標(biāo)志物，檢測干細(xì)胞產(chǎn)品中是否含有癌變或易癌變的細(xì)胞，這些細(xì)胞具有較高的致瘤性。一些常用的技術(shù)有流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光、實(shí)時熒光定量PCR等。
基因穩(wěn)定性檢測：利用特異性引物或探針，對干細(xì)胞產(chǎn)品中存在的基因突變、缺失、重排等異常進(jìn)行檢測，以評估其是否影響細(xì)胞的正常功能或調(diào)控，導(dǎo)致成瘤或致瘤。例如，利用TP53、KRAS、EGFR等引物或探針，檢測干細(xì)胞產(chǎn)品中是否含有與腫瘤相關(guān)的基因突變。利用FISH、CGH等技術(shù)，檢測干細(xì)胞產(chǎn)品中是否含有與腫瘤相關(guān)的染色體異常。一些常用的技術(shù)有實(shí)時熒光定量PCR、FISH、CGH等。
免疫相容性檢測：利用特異性抗體或抗原，對干細(xì)胞產(chǎn)品中表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合物（MHC）分子進(jìn)行檢測，以評估其與受者體內(nèi)MHC分子的匹配程度，以及其對受者體內(nèi)免疫系統(tǒng)的影響。例如，利用HLA-A、HLA-B、HLA-C等抗體，檢測干細(xì)胞產(chǎn)品中是否含有與受者相同或相似的MHC I分子，這些分子可以減少免疫排斥反應(yīng)，但也可能增加腫瘤逃逸反應(yīng)。利用HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP等抗體，檢測干細(xì)胞產(chǎn)品中是否含有與受者不同或不相似的MHC II分子，這些分子可以增加免疫監(jiān)視反應(yīng)，但也可能增加免疫攻擊反應(yīng)。一些常用的技術(shù)有流式細(xì)胞術(shù)、PCR-SSP、PCR-SSO等。
2023-10-16 |
